1、新柱柱效測試,為何塔板數明顯偏低?
·確保系統狀態正常,如有必要再沖洗一次。
·柱效受系統死體積擴散影響。沃特世(Waters®)色譜柱出廠測試是在體積zui小化的系統上進行,塔板數較高。通常自測如能達到70%以上,就可以接受。
·色譜柱體積越小,系統死體積(管路、檢測器流通池)對柱效的影響就越大。對于小內徑色譜柱(2.1和3 mmid)、和/或短的色譜柱(≤10cm),盡可能減少系統死體積(管路長度/內徑、流通池),并仔細檢查管路與色譜柱的連接。檢測器采樣頻率應設置為20 Hz。
·用什么條件和什么樣品測試的?峰保留時間越短,越容易受系統死體積影響。建議調整流動相條件,使峰保留時間在10分鐘(常規HPLC系統)或5分鐘(UHPLC系統)。
·樣品進樣體積越大,樣品溶劑會導致峰擴散。HPLC柱可進樣1 μL,UPLC柱可進樣0.1 μL。
2、新柱上機,基線一直不能平衡,怎么辦?
·首先斷開檢測器,按照對色譜柱的高洗脫強度溶劑5倍柱體積或者重復5次梯度沖洗色譜柱,然后按照測試柱效的方法測試。
·無規律的噪音,可考慮是否有氣泡進入檢測池,沃特世儀器用戶請撥打免費售后,獲得沖洗檢測池指導。
·規律性的上下波動基線,可考慮是否泵混合效率不足,在泵后增加mixing loop,具體請咨詢儀器維修工程師。
·實驗室內的環境條件是否會干擾到儀器,以及色譜柱柱溫情況。
·如果基線緩慢上飄或下飄,檢查流動相是否存在配制不均勻、或者在緩慢揮發的情況。
·更換同類型的舊柱情況會如何?有時需要對新色譜柱進行一定的老化(可以運行幾次梯度方法)。
3、新柱一進樣峰就拖尾,是色譜柱已經壞了嗎?
·檢查系統狀態正常,檢查管路與色譜柱連接無死體積。
·對新色譜柱進行柱效測試,檢查是柱效問題還是應用問題(可向我們索取柱效測試標準品或標準品配方)。
- 若柱效測試峰塔板數明顯偏低,請參考問題1。
- 若柱效測試結果正常,判斷為應用問題。
請考慮:這根色譜柱是否適合這個應用項目?過去那根舊色譜柱在進行這個項目測試時,色譜柱是否已經被離子對條件或其他改性條件用過?
4、新柱不能重現舊色譜柱譜圖,是色譜柱的批次問題嗎?
·新色譜柱是否需要老化或充分的活化平衡?舊色譜柱是否在測試項目以前經歷過變性條件(如離子對試劑)?項目之前用過不同批次色譜柱測試并能重現嗎?
·如手頭有可用的舊柱,請對同一個樣品、同一系統、同一配制流動相進行平行比對(同1天或隔天),建議每根色譜柱上。重復3次平行進樣。如果兩根色譜柱上的各自3針進樣譜圖均穩定重現(可完全重疊,沒有增減),而兩根色譜柱的譜圖有所差異(個別峰的增加/丟失/分離改變),可確認兩柱有差異。可能該項目條件敏感,導致對色譜柱批次敏感(“挑批次”)。
·如有可能,優化分析方法,并用至少兩根以上不同填料批次的色譜柱進行方法重現性檢查。
5、新柱連續進樣,保留時間不穩定,一直有漂移,怎么回事?
·色譜柱的平衡有沒有充分,尤其是使用離子對試劑的情況下。
·流動相配制是否足夠均勻,比如磷酸鹽與乙腈需要劇烈震搖混合,超聲混合不充分。
·流動相是否存在揮發性組分,導致緩慢變化。
·是否使用柱溫箱,或者色譜柱是否暴露在溫度變化較大的環境中(如空調風口等)。
·親水作用色譜柱(如XBridge Amide柱,XBridge/Atlantis/CORTECS HILIC柱),需要活化步驟,以及較長時間的再平衡,請詢我們。
·進行柱效測試,連續進針,看保留時間是否漂移,確認儀器狀態是不是穩定的